ANALYSES MICROBIOLOGIQUES en collaboration avec BRUCEFO

MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE

Allergies AlimentairesLa sécurité et la conservation des produits alimentaires occupent de nos jours une place importante dans les critères de choix d’achat des consommateurs.
Les industriels se doivent de maîtriser la qualité microbiologique de leurs produits dans le cadre du BRC et de l’HACCP mais également, afin d’éviter une mauvaise publicité due à une affaire d’intoxication ou tout simplement de prévenir des pertes de production.
Le LSTA met à la disposition des industriels une large gamme d’analyses permettant la recherche, le dénombrement et l’identification de nombreux micro-organismes.
Le LSTA peut également évaluer la durée de vie biologique des produits. Pour ce faire le laboratoire dispose de plusieurs tests dont : les "challenge" tests et les tests de vieillissement en chambres climatiques à température et humidité contrôlées.

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RECHERCHE ET DÉNOMBREMENT DE MICRO-ORGANISMES


DÉNOMBREMENT EN MILIEU SOLIDE DANS LA MASSE OU PAR ÉTALEMENT EN SURFACE

Exemples :

Allergies AlimentairesFlore aérobie mésophile totale
Bactéries lactiques
Levures et moisissures
Salmonella spp
Staphylocoques
Coliformes dont Escherichia coli
Coliformes thermotolérants
Listeria monocytogenes
Sulfito-réducteurs dont Clostridium perfringens
Pseudomonas spp
Enterobacteriaceae
Bacillus cereus
Brochotrix thermosphacta

DÉNOMBREMENT SUR MEMBRANE PAR FILTRATION POUR LES ÉCHANTILLONS LIQUIDES

Exemples :

Flore aérobie mésophile totale
Bactéries lactiques
Levures et moisissures

Allergies Alimentaires

DÉNOMBREMENT EN MILIEU LIQUIDE OU TECHNIQUE DE NUMÉRATION EN TUBES MULTIPLES

Permettant de déterminer un nombre probable de micro-organismes (méthode NPP ou nombre le plus probable).

Exemple : Escherichia coli présumé


IDENTIFICATION DES BACTÉRIES CONTAMINANT LA BIÈRE PAR RT-PCR (Real Time – Polymerase Chain Reaction)

Le principe de base de la RT-PCR est le même que celui de la PCR classique, à savoir multiplier un fragment d’ADN spécifique par amplification successive de celui-ci à l’aide d’une amorce, de nucléotides et d’une polymérase thermostable.

La réaction d’amplification consiste en la succession de cycles (+/- 45 cycles). Typiquement un cycle est composé de trois étapes (dénaturation / hybridation / élongation). Chaque cycle permet le doublement par la réalisation d’une copie de chaque brin d’ADN se trouvant dans le milieu réactionnel. La succession de cycle permet une augmentation exponentielle du brin amplifié.

La RT-PCR se différencie de la PCR classique lors de la visualisation des résultats. Alors qu’en PCR classique, il faut attendre la fin de l’ensemble des cycles pour constater l’amplification ou non d’un brin d’ADN, la RT-PCR permet un suivi tout au long de la réaction. C’est l’ajout de sondes fluorescentes au milieu réactionnel qui permet de visualiser l’amplification tout au long de la réaction.

Les sondes fluorescentes sont ajoutées dans le milieu réactionnel en excès dès le départ. Plus il y a d’ADN, plus il y a de sondes qui émettent de la fluorescence selon différentes interactions.

A la fin de la réaction d’amplification, on augmente graduellement la température (38°C à 80°C) et on réalise en parallèle une mesure continue de la fluorescence (principe de la courbe de fusion). L’augmentation de la température aura pour effet la séparation des doubles brins d’ADN amplifiés et donc indirectement la diminution de la fluorescence émise.
La courbe de fluorescence mesurée est propre à un segment d’ADN. Deux segments d’ADN différents auront des courbes différentes.

Les résultats obtenus en RT-PCR se présentent sous forme de graphiques.
Pour l’amplification du brin d’ADN, l’intensité de la fluorescence émise par la sonde est portée en ordonnée et le nombre de cycles réalisés en abscisse. Le graphe obtenu est une sigmoïde.
En ce qui concerne la courbe de fusion, si l’on réalise sa dérivée première négative, on obtient un graphique présentant un ou plusieurs pics. Le nombre de pics et leur position permettent d’identifier le brin d’ADN amplifié.

Dans le cas des bactéries contaminant la bière, nous pouvons détecter et identifier les principaux contaminants appartenant à la famille des Lactobacilles (L. brevis, L. casei,...), des Pédiocoques (P. damnosus, P.claussenii,...), des Pectinatus et des Megasphera.

Courbes Melting
Courbes Melting

DÉTECTION RAPIDE DE BACTÉRIES PATHOGÈNES PAR RT-PCR (Real Time – Polymerase Chain Reaction)

Sur le même principe que l’identification des bactéries contaminant la bière, la RT-PCR nous permet de détecter rapidement dans les aliments toute une gamme de bactéries pathogènes pour l’homme comme : Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, Escherichia coli O157, Candida albicans.


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DURÉE DE VIE BIOLOGIQUE DES ALIMENTS


TEST DE VIEILLISSEMENT POUR LA VALIDATION DE LA DLC

Les denrées périssables réfrigérées, non stables à température ambiante, peuvent évoluer organoleptiquement mais également microbiologiquement. Le producteur doit déterminer une DLC* en prenant en compte tous les paramètres physico-chimiques, organoleptiques et microbiologiques de son produit.

Le LSTA propose de réaliser des analyses microbiologiques en cours et en fin de DLC afin de vérifier que les limites microbiologiques s’appliquant au produit ne soient pas dépassées.

Allergies AlimentairesLes tests réalisés se basent sur un protocole décrit dans la norme NF V01-003, l’utilisation de chambres climatiques à régulation de température et/ou d’humidité permet une maîtrise parfaite des conditions de vieillissement des produits. Différents protocoles (changement de température et/ou d’humidité au cours du vieillissement) simulant des ruptures de la chaîne du froid peuvent être appliqués aux produits.

* Pour déterminer la DLC d’un produit, le LSTA met également à disposition des industriels les compétences de ses services : Analyses Sensorielles et Formulations, Stabilité et Analyses.


"CHALLENGE" TESTS

Les protocoles de réalisation des "challenge" tests et autres tests de croissance microbiologique sont repris dans la norme NF V 01-009.

Le principe consiste à évaluer l’accroissement de la population d’un micro-organisme (= potentiel de croissance (δ)) dans un aliment inoculé artificiellement avec ce même micro-organisme.
Cette croissance sera estimée par la mesure à deux points (le jour 0 (jour de sortie de production) et à la Date Limite de Consommation (DLC)).

Les buts sont :

  • De confirmer que les propriétés physico-chimiques de l’aliment (PH, activité d’eau) et/ou son conditionnement (atmosphère modifiée) rendent la multiplication du micro-organisme concerné impossible.
  • Dans le cas où l’aliment permet un développement du micro-organisme, de déterminer une valeur de tolérance à la sortie de production.

Courbe croissance microLa réalisation de plusieurs points de mesure permet l’obtention d’une courbe de croissance, la détermination du taux de croissance du micro-organisme ainsi que sa phase de latence. (Informations pouvant être intéressantes pour le producteur).

Estimation du taux de croissance (µmax)
µmax = pente de la droite en phase exponentielle de l’équation ln (population) = f(temps)

Estimation du temps de latence (λ)
λ = intersection de la droite correspondant à la phase de croissance exponentielle et la droite horizontale passant par la concentration initiale.


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