ALLERGIES ET INTOLERANCES ALIMENTAIRES



ALLERGIES ET INTOLÉRANCES ALIMENTAIRES

Allergies AlimentairesSuite à la forte croissance, ces dernières années, du nombre de personnes souffrant d’allergies alimentaires et aux changements apparus au niveau de la législation, le LSTA a validé plusieurs méthodes de dosage des allergènes afin de venir en aide aux industries agroalimentaires.

Les méthodes utilisées sont la PCR en temps réel (RT-PCR : Real Time – Polymerase Chain Reaction), l’ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), et le dosage enzymatique.

L’utilisation de ces trois méthodes au sein de notre laboratoire nous permet de détecter les 14 allergènes repris dans la législation et devant obligatoirement être étiquetés.

En fonction des allergènes analysés et des matrices, la sensibilité d’une technique par rapport aux autres sera privilégiée.

Ces méthodes peuvent être directement appliquées à la détection dans un aliment ou être utilisées pour assurer la validité du système de nettoyage mis en place sur la chaîne de production.

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TABLEAU DES TECHNIQUES ANALYSANT LES SUBSTANCES PROVOQUANT ALLERGIE OU INTOLÉRANCE


Allergies Alimentaires


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LÉGISLATION

Suite à l’augmentation observée de la prévalence de l’allergie en général, l’Union Européenne a mis sur pied une série de directives légiférant l’étiquetage des aliments afin d’informer le consommateur du contenu des aliments qu’il consomme.

Pour ce faire, le Parlement Européen et le conseil ont publié les directives 2003/89/CE, 2005/26/CE, 2005/63/CE et 2006/142/CE venant modifier et compléter la directive 2000/13/CE concernant l’étiquetage et la présentation des denrées alimentaires ainsi que la publicité faite à leur égard.

La directive 2003/89/CE oblige l’étiquetage d’une liste de 12 ingrédients et supprime la règle des 25% (règle où les composants d’un ingrédient composé, utilisé à moins de 25% du produit fini ne devaient pas nécessairement être mentionnés sur l’étiquetage).

Les directives 2006/142/CE et 2007/68/CE modifient l’annexe III bis (ajout des substances allergènes Lupin et mollusque à la liste des 12 ingrédients, ce qui porte la liste à 14 ingrédients devant obligatoirement être étiquetés; ainsi qu’une liste d’ingrédients alimentaires provisoirement exclus de l’obligation d’étiquetage. (Exemple : huile de moutarde...)

LISTE DES 14 INGREDIENTS EN OBLIGATION D’ÉTIQUETAGE

  • Céréales contenant du gluten (blé, seigle, orge, avoine, épeautre, Kamut ou leurs souches hybridées) et les produits à base de ces céréales
  • Crustacés et produits à base de crustacés
  • Oeufs et produits à base d’oeufs
  • Poissons et produits à base de poissons
  • Arachides et produits à base d’arachides
  • Soja et produits à base de soja
  • Lait et produits à base de lait (y compris le lactose)
  • Fruits à coque, à savoir amandes, noisettes, noix, noix de cajou, noix de pécan, noix du Brésil, pistache, noix de Macadamia et noix du Queensland, et produits à base de ces fruits
  • Céleri et produits à base de céleri
  • Moutarde et produits à base de moutarde
  • Graines de sésame et produits à base de graines de sésame
  • Anhydride sulfureux et sulfites en concentrations de plus de 10 mg/kg ou 10 mg/litre exprimées en SO2
  • Lupin et produits à base de lupin
  • Mollusques et produits à base de mollusques

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MATÉRIEL ET MÉTHODES UTILISÉES


LA TECHNIQUE RT-PCR OU PCR EN TEMPS RÉEL

Allergies AlimentairesLe principe de base de la RT-PCR (Real Time – Polymerase Chain Reaction) est le même que celui de la PCR classique, à savoir multiplier un fragment d’ADN spécifique par amplification successive de celui-ci à l’aide d’une amorce, de nucléotides et d’une polymérase thermostable.

La réaction d’amplification consiste en la succession de cycles (+/- 45 cycles).
Typiquement un cycle est composé de trois étapes :

  • Dénaturation (0 - 1 min à 95°C)
  • Hybridation (2 - 60 s à 56 - 64°C)
  • Elongation (4 - 120 s à 72°C = t° optimale pour l’activité de la Taq polymérase)

La première étape (dénaturation) consiste en la séparation du double brin d’ADN.
Lors de l’étape d’hybridation, les amorces (courtes séquences d’ADN complémentaires à l’ADN que l’on veut amplifier) vont se lier au brin d’ADN cible.
La dernière étape (l’élongation) permet de synthétiser à partir du brin d’ADN cible, un nouveau brin d’ADN grâce aux nucléotides et à la Taq polymérase présente en solution.

Allergies AlimentairesChaque cycle permet le doublement de chaque brin d’ADN se trouvant dans le milieu réactionnel. La succession de cycle permet une augmentation exponentielle du brin amplifié.

La RT-PCR se différencie de la PCR classique lors de la visualisation des résultats. Alors qu’en PCR classique, il faut attendre la fin de l’ensemble des cycles pour constater l’amplification ou non d’un brin d’ADN, la RT-PCR permet un suivi tout au long de la réaction. C’est l’ajout de sondes fluorescentes au milieu réactionnel qui permet de visualiser l’amplification tout au long de la réaction. Les sondes fluorescentes sont ajoutées dans le milieu réactionnel en excès dès le départ. Plus il y a d’ADN, plus il y a de sondes qui émettent de la fluorescence selon différentes interactions (hydrolyse ou hybridation de la sonde).

Les résultats obtenus en RT-PCR se présentent sous forme de graphique où l’intensité de la fluorescence émise par la sonde est portée en ordonnée et le nombre de cycles réalisés en abscisse. Le graphe obtenu est une sigmoïde.


Courbes d'amplificationLors d’une détection qualitative, on considère un test positif lorsqu’une sigmoïde se dessine et un test négatif lorsque aucun signal n’apparaît.

En analyse quantitative, on se base sur des sigmoïdes issues des standards. Au plus la sigmoïde se trouve à droite sur le graphe (besoin de beaucoup de cycles pour démarrer l’amplification), au moins il y a de l’ADN dans l’échantillon de départ.

Contrairement à l’ELISA, la RT-PCR est considérée comme technique indirecte pour le dosage des allergènes puisque les protéines (responsables des réactions allergiques) ne sont pas dosées.
La technique RT-PCR permet de descendre à des limites de détection proches de celles de l’ELISA (quelques ppm).


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LA TECHNIQUE ELISA

Allergies AlimentairesLa technique ELISA consiste à détecter les allergènes ou les protéines servant de marqueurs spécifiques par liaison avec un anticorps marqué par une enzyme.
La technique ELISA permet, en théorie, une quantification de l’allergène recherché grâce à l’utilisation de standards. En pratique, les matrices alimentaires et les traitement industriels subis par l’aliment interfèrent sur l’extraction et la détection des protéines ce qui rend une quantification exacte hasardeuse. La limite de détection de cette technique se situe aux alentours de quelques ppm (variable avec la matrice et l’allergène recherché).
Il existe deux variantes de l’ELISA toutes deux applicables à la détection des allergènes alimentaires : L’ELISA sandwich (ou non compétitive) et l’ELISA compétitive.

Allergies AlimentairesL’ELISA sandwich consiste à fixer des anticorps spécifiques de l’antigène recherché sur un support solide (puits). Les protéines (antigènes) spécifiques de l’échantillon à analyser se lient alors aux anticorps fixés au fond des puits. On ajoute ensuite un second anticorps, marqué par une enzyme, reconnaissant également l’antigène à mettre en évidence. Il y a ainsi formation d’un sandwich (anticorps-antigène-anticorps) révélé par l’ajout d’un substrat chromogène. Le signal, mesuré par spectrophotomètre, est proportionnel à la quantité d’allergènes présente dans l’échantillon.

L’ELISA compétitive repose sur une compétition entre antigènes (allergènes) marqués et allergènes de l’échantillon. Dans ce cas-ci, on dispose également de puits au fond desquels des anticorps spécifiques sont fixés. L’échantillon et la solution d’antigènes marqués sont introduits dans les puits. Les allergènes contenus dans l’échantillon rentrent alors en compétition avec les allergènes marqués pour la fixation sur les anticorps. Les antigènes marqués se fixeront sur les anticorps non occupés par les allergènes de l’échantillon. Le signal final sera inversement proportionnel à la quantité d’antigènes dans l’échantillon.


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LE DOSAGE ENZYMATIQUE

Le dosage du lactose et des sulfites par méthode enzymatique consiste à mesurer la formation (cas du lactose) ou la consommation (cas des sulfites) du coenzyme NADH à l’aide d’un spectrophotomètre à 340 nanomètre.

Cas du lactose :
Lorsqu’un échantillon contient du lactose, ce dernier sera hydrolysé en glucose et en galactose à l’aide d’une enzyme.
Le galactose réagira avec du NAD+ pour former le coenzyme NADH.
La quantité de NADH formée au cours de la réaction, et mesurée à l’aide du spectrophotomètre, permet de calculer la quantité de lactose présente dans l’échantillon.

Cas des sulfites :
Lorsqu’un échantillon contient des sulfites, ce dernier sera oxydé en sulfates en présence d’oxygène. Cette réaction produira également du peroxyde d’hydrogène.
Le peroxyde d’hydrogène réagira avec le coenzyme NADH pour former du NAD+.
La quantité de NADH consommée au cours de la réaction, et mesurée à l’aide du spectrophotomètre, permet de calculer la quantité de sulfite présent dans l’échantillon.


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